De retour à Antioche, Paul et Barnabas encouragèrent l'Eglise et s'engagèrent davantage dans l'œuvre évangélique. C'est apparemment la dernière fois qu'ils ont travaillé ensemble, car un net désaccord provoqua leur séparation. La raison de ce désaccord? Marc, le cousin de Barnabas (Col 4.10). Quand Paul invita Barnabas à retourner clans les endroits qu'ils avaient évangélisés lors de leur précèdent voyage, Barnabé voulut prendre avec lui son cousin, mais Paul n'était pas d'accord, à cause d'un échec passé de Marc (Ac 13.13).

Mais la séparation de Paul et Barnabas se changea en bénédiction, car en dissociant leurs efforts, ils purent couvrir une zone plus grande qu'ils ne l'avaient prévu initialement. Barnabas prit Marc et retourna à Chypre, terre natale de Barnabas (Ac 4.36). Pendant ce temps-là, ayant invité Sillas à le rejoindre, Paul alla en Syrie et en Cilicie, fortifiant les Eglises. Avant de venir à Antioche la première fois, Paul avait passé plusieurs années à Tarse (Ac 9.30; 11.25,26). A présent, il avait l'occasion de visiter à nouveau les congrégations qu'il y avait établies. Néanmoins, le plan de Dieu pour lui était bien plus grand que Paul se l'était imaginé au départ.